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Unità di Cristallografia

Coordinatore

Sebastiano Pasqualato

"Quasi tutti gli aspetti della vita sono progettati a livello molecolare, e senza la comprensione delle molecole possiamo avere soltanto una comprensione molto lacunosa della vita stessa" Francis Crick, What Mad Pursuit: A Personal View Of Scientific Discovery (La folle caccia, Rizzoli, 1990)

Mission e servizi dell'Unità di Cristallografia
La cristallografia a raggi X è la tecnica d'elezione utilizzata in biologia strutturale per determinare la struttura tridimensionale delle macromolecole. Si devono alla cristallografia l'elucidazione dei meccanismi di azione degli enzimi, la determinazione delle strutture di ribosomi, motori molecolari, virus, oltre alla rivoluzionaria scoperta della struttura del DNA.

Durante l'ultimo decennio, importanti sviluppi tecnologici hanno reso questa tecnica più facilmente accessibile. L'utilizzo di high-throughput robots permette il rapido set up delle prove di cristallizzazione con minime quantità di campione; quello di brillanti sorgenti di raggi X ai sincrotroni e delle cryo-temperature consentono raccolte dati molto veloci; il miglioramento dei programmi e della potenza di calcolo hanno notevolmente semplificato le fasi della determinazione delle strutture e del loro affinamento.
Tuttavia, una grande attenzione deve ancora essere dedicata alla preparazione e caratterizzazione dei campioni da cristallizzare, fattori cruciali per aumentare le possibilità di successo della fase di cristallizzazione.

L'Unità di Cristallografia supporta i gruppi scientifici che sono interessati a sviluppare gli aspetti di biologia strutturale dei loro progetti. Fornisce sia un servizio di consulenza avanzata che specifici servizi per l'espressione di proteine, la loro purificazione, caratterizzazione, cristallizzazione e la determinazione delle strutture.

L'Unità gestisce una piattaforma per l'espressione di proteine in cellule di insetto, purificazione e caratterizzazione di proteine e complessi macromolecolari, otre che infrastrutture per la cristallografia a raggi X.

  • Research activities

    Crystallography


    L'Unità offre i seguenti servizi:

    • assistenza nella progettazione di strategie di clonaggio volte alla produzione e purificazione di proteine;
    • espressione di proteine in cellule di insetto con il sistema di espressione baculovirus;
    • caratterizzazione biochimica di campioni macromolecolari;
    • misurazioni di affinità di legame di complessi macromolecolari;
    • set up di prove di cristallizzazione e ottimizzazione dei cristalli;
    • raccolta dati, determinazione di struttura tridimensionali, analisi delle strutture.


    Assistenza nella progettazione di strategie di clonaggio volte alla produzione e purificazione di proteine
    Per aumentare le probabilità di cristallizzazione, idealmente i campioni macromolecolari devono essere estremamente puri ed omogenei, ad alta concentrazione e monodispersi. Per produrre dei campioni con queste caratteristiche, occorre identificare ed esprimere i migliori costrutti proteici in termini di stabilità e solubilità.
    L'Unità fornisce assistenza nell'analisi della predizione della struttura secondaria, nonché nelle strategie di espressione e purificazione proteica. La nostra esperienza in termini di produzione e purificazione di complessi proteici può essere particolarmente utile a coloro che sono interessati  allo studio dei meccanismi molecolari di sistemi biologici complessi.

    Espressione di proteine in cellule di insetto con il sistema di espressione baculovirus
    Il sistema di espressione baculovirus consente elevati livelli di espressione di proteine ricombinanti in cellule di insetto. Rispetto all’espressione di proteine in batteri, ha il vantaggio di consentire la produzione di costrutti più grandi che, grazie alla cellula eucariota, potranno avere le corrette modificazioni post-traduzionali. Un recente sviluppo di questa tecnologia è il sistema MultiBac, che permette l’espressione di complessi multi-proteici.
    L'Unità di Cristallografia offre un servizio completo, che va dal clonaggio nei vettori appropriati all’espressione delle proteine (o complessi multi-proteici) in cellule di insetto con il sistema MultiBac, fino alla purificazione delle proteine espresse.

    Caratterizzazione biochimica di campioni macromolecolari
    Per determinare gli stati oligomerici di campioni macromolecolari in soluzione, l’Unità è fornita di uno strumento per la misurazione dello Static Light Scattering. Il campione viene corso su una cromatografia di esclusione dimensionale e il materiale eluito viene analizzato attraverso un triplo detector che permette la determinazione del peso molecolare assoluto delle specie in soluzione.
    La stabilità delle proteine in diversi tamponi può essere valutata grazie alla Differential Scanning Fluorimetry. Questa tecnica può anche essere utilizzata per identificare ligandi a basso peso molecolare che stabilizzino le proteine. L'Unità offre queste analisi come servizio agli utenti.

    Misurazioni di affinità di legame di complessi macromolecolari
    Le affinità di legame e la stechiometria di complessi macromolecolari possono essere misurati con uno strumento di Isothermal Titration Calorimetry. Nel caso in cui il complesso sia tra una proteina e piccoli polipeptidi o oligonucleotidi, l’affinità di legame può essere determinata utilizzando minori quantità di campione grazie a saggi di Fluorescence Polarization.
    L'Unità fornisce assistenza nella progettazione ed esecuzione di queste misure.

    Set up di prove di cristallizzazione e ottimizzazione dei cristalli
    L’Unità dispone di una piattaforma automatizzata per la cristallizzazione high-throughput di campioni macromolecolari, al fine di massimizzare il tasso di successo delle prove iniziali con minime quantità di campione. Una serie di condizioni di cristallizzazione, scelte tra una dozzina di screen commerciali, vengono provate inizialmente. Un robot nano-dispensatore permette lo screening di 288 condizioni con 50 ul di campione, in condizioni di diffusione di vapore in sitting-drops, con gocce di 200 nl in piastre da 96 pozzetti. Questi screening possono essere conservati a 20 °C o a 4 °C. Le piastre a 20 °C vengono fotografate a intervalli di tempo prestabiliti per seguire l’apparizione di eventuali cristalli. Le immagine sono disponibili on-line agli utenti, che possono monitorare a distanza l’apparire e la crescita dei cristalli. L’ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione iniziali viene in genere eseguita manualmente in piastre da 24 pozzetti, in hanging drops con gocce da 2 ul. In questi casi vengono preparati degli screens personalizzati, in base alle condizioni   di cristallizzazione iniziali.
    L'Unità Cristallografia offre un servizio completo, dal set up delle prime prove di cristallizzazione all'ottimizzazione di eventuali cristalli. Gli utenti esperti hanno libero accesso ai reagenti e alle strumentazioni dell’Unità.

    Raccolta dati, determinazione di struttura tridimensionali, analisi delle strutture
    Al fine di determinarne la struttura tridimensionale, i cristalli di macromolecole devono essere irradiati con un fascio di raggi X monocromatico altamente collimato e le immagini di diffrazione devono essere raccolte e processate.
    L'Unità Cristallografia offre il servizio di raccolta dati presso fonti di luce al sincrotrone e di elaborazione dati, che porta alla determinazione della struttura. Grazie alla stretta collaborazione con il gruppo scientifico della Dr.ssa Marina Mapelli, l'Unità ha la possibilità di accedere regolarmente a tempo macchina presso presso l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF -Grenoble -F) e lo Swiss Light Source (SLS - Villigen - CH). I dati vengono elaborati in-house con suite di software cristallografici installati e mantenuti dall'Unità con l'aiuto del servizio ICT IEO.

UN PICCOLO GESTO E' PER NOI UN GRANDE AIUTO

PARTNERSHIP

Università degli Studi di Milano Ecancer Medical Science IFOM-IEO Campus

ACCREDITAMENTI

Ministero della Salute Joint Commission International Breastcertification bollinirosa

© 2013 Istituto Europeo di Oncologia - via Ripamonti 435 Milano - P.I. 08691440153

IRCCS - ISTITUTO DI RICOVERO E CURA A CARATTERE SCIENTIFICO

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