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Analisi dei diversi livelli di regolazione dell'espressione genica mediante proteomica funzionale quantitativa

Direttore

Tiziana Bonaldi

HIGHLIGHT

 

Siamo parte del Consorzio LIBRA (http://www.eu-libra.eu), un'Azione di Coordinamento e Supporto finanziata dalla Commissione Europea all'interno del Programma Quadro H2020 con la finalità di incentivare la parità di genere nella ricerca.

Attività

L’obiettivo perseguito dal gruppo è studiare i diversi livelli di regolazione dell’espressione genica, utilizzando la spettrometria di massa (MS) come tecnica di elezione per analizzare questi processi con approcci di proteomica dei sistemi (systems proteomics). Storicamente la nostra ricerca si concentra sui meccanismi epigenetici di regolazione della trascrizione, mediati dalle modifiche post-traduzionali degli istoni (hPTMs); più recentemente abbiamo esteso le nostre indagini anche a meccanismi regolativi post-trascrizionali.
In particolare studiamo:
- Le combinazioni di hPTMs a livello di singolo istone, di mono- e poli-nucleosoma, fino ad arrivare al livello di piccoli frammenti di cromatina;
- L’attività degli enzimi che modificano gli istoni e l’aspetto quantitativo legato alla dinamicità delle modifiche in relazione a diversi stati funzionali
- La metilazione di proteine non istoniche e i processi cellulari collegati a questa; - Gli eventi post-trascrizionali regolanti l’espressione genica, con un interesse particolare all’attivita’ di inibizione traduzionale dei microRNA,.
Mediante tecniche di spettrometria di massa di ultima generazione, abbiamo l’ambizione di sviluppare e applicare approcci proteomici innovativi e non convenzionali per acquisire una visione originale sui molteplici processi regolativi dell’espressione genica.

  • Progetti di ricerca

    Cromatomica: proteomica di regioni cromatiniche tramite approccio ChroP
    La cromatina é un complesso macromolecolare composto di acidi nucleici e proteine, molto dinamico e architettonicamente composito, mediante il quale la cellula modula diversi processi  sul DNA. La plasticità e funzionamento della cromatina sono a loro volta mediati dalla sinergia tra la metilazione del DNA, le modifiche post-traduzionali degli istoni, l’arricchimento di varianti istoniche specifiche e di altri fattori nucleari specificamente reclutati a determinati loci .
    Sino ad oggi la caratterizzazione completa della composizione proteica della cromatina é stata limitata dalla mancanza di metodologie in grado di arricchire domini cromatinici definiti in quantità e purezza tali da consentire la successiva analisi per MS. Il nostro gruppo ha definito un protocollo nuovo che combina l’arricchimento di regioni funzionalmente distinte di cromatina mediante immunoprecipitazione (ChIP) con la proteomica quantitativa basata sulla marcatura delle proteine cellulari con isotopi stabili (SILAC). Questo protocollo, chiamato Chro (Chromatin Proteomics) permette di identificare modifiche istoniche, varianti istoniche e complessi associati a domini chromatin specifici, rivelando interazioni funzionali nuove tra diversi determinanti proteici e suggerendo l’esistenza di nuovi meccanismi regolatori. Per esempio, l’analisi ChroP su eterocromatina ha indicato che l’arricchimento in questa regione della variante istonica H2A.X e dal complesso di rimodellamento della cromatina WICH correla con una modulazione specifica della riposta al danno al DNA (Soldi and Bonaldi, MCP 2013).
    Attività in corso: Stiamo sviluppando una versione implementata dell’approccio ChroP, definita come ChroP2.0, per caratterizzare gli enhancers dei geni infiammatori nei macrofagi, sia  in condizioni basali,  sia in seguito a stimolazione infiammatoria con LPS, utilizzando H3K4me1 in combinazione con Pu.1, come “ganci” per  il passaggio di immunoprecipitazione.

    Approcci quantitativi di spettrometria di massa per decifrare la complessità della metilazione proteica di substrati non istonici (il metil-proteoma cellulare)
    La metilazione delle proteine è una modifica post-traduzionale attraverso la quale un numero variabile di gruppi metilici è trasferito agli aminoacidi Lisina e Arginina delle proteine. Non ostante, il crescente interesse rispetto a questa modifica post-traduzionale, risvegliato dalla scoperta della sua natura reversibile e del suo coinvolgimento in svariati processi regolativi e in molte patologie, la caratterizzazione sistematica delle proteine metilate non istoniche (metil-proteoma) rimane un obiettivo ancora da perseguire. Per condurre questa caratterizzazione abbiamo impiegato un approccio proteomico che combina la MS con una variazione della strategia SILAC denominata heavy-methyl SILAC (hmSILAC), che utilizza Metionina arricchita in isotopi stabili per marcare specificamente le metilazioni enzimatiche presenti sulle proteine. Utilizzando un’ampia gamma di anticorpi anti-pan-Kme e anti-pan-Rme per arricchire le proteine metilate mediante immunoprecipitazione, abbiamo identificato 501 metilazioni in totale, presenti su 370 residui aminoacidici distinti, appartenenti a 127 proteine. Questo risultato espande considerevolmente il numero di metilazioni note e mostra come questa modifica sia arricchita soprattutto nei complessi proteici costituititi da molte subunità e coinvolti nella regolazione dell’espressione genica a diversi livelli (Bremang et al. Mol. BioSystems, 2013).
    Attività in corso: stiamo ottimizzando ulteriormente i metodi biochimici e analitici per estendere la copertura del metil-proteoma; contemporaneamente stiamo studiando il ruolo della metilazione nella regolazione del Large Drosha/Microprocessor Complex nonché’ la modulazione del metiloma in risposta a danno al DNA e in seguito alla deplezione di diverse PRMTs madiante siRNA, in collaborazione con Ernesto Guccione (IMCB,Singapore).

    Identificazione dei target di miR17-92 in un modello murino di Burkitt linfoma mediante proteomica quantitativa
    L’effetto funzionale dell’attività dei microRNA dipende dal contesto molecolare in cui sono espressi: lo stesso microRNA può infatti svolgere funzioni molecolari diverse o addirittura antitetiche  in differenti stadi di un determinato processo biologico, come per esempio la tumorigenesi. Il ruolo oncogenico del cluster di microRNA miR-17-92 é stato ampiamente descritto durante la linfomagenesi in un modello murino di Burkitt linfoma: in questa fase iniziale di sviluppo del tumore il cluster sinergizza con l’oncogene MYC accelerando la comparsa del cancro. Il nostro interesse invece è comprendere quale sia il contributo del cluster nella fase di mantenimento del tumore, attraverso la sua interazione funzionale con altri regolatori chiave dell’espressione genica del tumore, come MYC stesso. Utilizzando un modello di linfoma di cellule B dipendente da MYC, abbiamo scoperto che l’over-espressione del cluster compromette la crescita del linfoma sia in vitro sia in vivo, con riducendone l’aggressività. Questo dato suggerisce che- nello stadio di mantenimento del tumore- miR-17-19b reprime la funzione di MYC, mostrando un’attività molecolare di onco-soppressione, antitetica a quella descritta durante la linfomagenesi in un modello murino quasi identico. Utilizzato un approccio di biologia dei sistemi che combina analisi proteomica quantitativa, transcrittomica, ChiP-seq e predizione computazionale, abbiamo investigato l’attivita’ di miR-17-19b tramite l’identificazione in larga scala dei suoi bersagli molecolari in questo modello di linfoma. Abbiamo identificato oltre 200 nuovi bersagli, la cui analisi funzionale ha rivelato che il 40% è sotto il controllo trascrizionale dell’oncogene MYC. Un numero rilevante di geni è dunque trascrizionalmente regolato da MYC e traduzionalmente represso da miR-17-92 (miR-mediated feed forward loop), generando cosi un’estesa rete di regolazione attraverso la quale l’effetto di MYC è tenuto sotto controllo fine.
    Attività in corso: Abbiamo identificato tra due nuovi bersagli di miR-1792 che stiamo caratterizzando in quando regolatori dell’espressione di MYC a diversi livelli: E2F1(regolatore della trascrizione) e Chek-2 (regolatore della traduzione). In particolare stiamo lavorando per chiarire il meccanismo molecolare mediante il quale la down-regolazione di Check-2 operata da mir-17-92 induca in ultima analisi la repressione della traduzione di MYC.

    Identificazione sistematica dei bersagli proteici di farmaci anti-tumorali mediante la proteomica chimica
    Un passaggio fondamentale nello sviluppo di un farmaco è rappresentato dall’identificazione sistematica dei suoi bersagli molecolari, per caratterizzarne in maniera completa la selettività e specificità e poter in questo modo predirne possibili effetti collaterali. Tradizionalmente  l’identificazione dei bersagli di una molecola che abbiamo un potenziale come farmaco è condotta mediante lo screening di un numero definito di bersagli selezionati, espressi singolarmente come proteine ricombinanti, la cui attività è valutata in saggi di inibizione enzimatica in vitro. La proteomica chimica è una strategia alternativa che permette lo screening di tutti i potenziali bersagli presenti in un intero proteoma,  attraverso saggi di cromatografia di affinità seguiti da analisi MS per identificare gli interratori del farmaco immobilizzato su resina.  Le condizioni in cui avviene l’interazione tra un farmaco e il suo bersaglio sono più fisiologiche e rappresentative dello stato funzionale di ciascuna proteina, rispetto ai saggi classici in vitro. Nell’ultimo decennio, l’elaborazione di strategie di proteomica quantitativa come il SILAC ha permesso di implementare la proteomica chimica con versioni più avanzate che permettono un più sicuro e accurato discernimento dei bersagli specifici dal background.
    Attività in corso: Deconvoluzione dei bersagli molecola del farmaco antitumorale E-3810, inibitore multiplo di recettori tirosin-chinasici    
    Abbiamo usato la chemo-proteomica in diversi disegni sperimentali basati sul SILAC per indentificare in maniera precisa e sistematica i bersagli dell’inibitore tirosin-chinasico E-3810 in cellule di carcinoma ovarico, determinandone i valori di Kd e IC50 per ciascuno dei bersagli proteici identificati. Questo studio ha permesso di ampliare lo spettro di possibili bersagli del composto rispetto a quelli già noti (VEGR e FGFR) e di selezionarne alcuni che potrebbero avere applicazione come target nella cura di tumori di tipo diverso. Inoltre l’identificazione di nuovi bersagli ha permesso di chiarire alcuni aspetti importanti legati al meccanismo molecolare di azione del composto e di predire possibili effetti collaterali inaspettati (Colzani et al, MCP 2014).

  • Pubblicazioni

    • Soldi M, Cuomo A, Bremang M, Bonaldi T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 2013 Mar 6;14(3):5402-31. doi: 10.3390/ijms14035402.
    • Vella P, Scelfo A, Jammula S, Chiacchiera F, Williams K, Cuomo A, Roberto A, Christensen J, Bonaldi T, Helin K, Pasini D. Tet Proteins Connect the O-Linked N-acetylglucosamine Transferase Ogt to Chromatin in Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 2013 Feb 21;49(4):645- 56. doi: 10.1016/j.molcel.2012.12.019. Epub 2013 Jan 24.
    • Soldi M, Bonaldi T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 2013 Mar;12(3):764-80. doi: 10.1074/mcp. M112.024307. Epub 2013 Jan 14.
    • Cuomo A, Moretti S, Minucci S, Bonaldi T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the “histone modification signature” of human breast cancer cells. Amino Acids. 2011 Jul;41(2):387-99. doi: 10.1007/s00726-010-0668-2. Epub 2010 Jul 9.
    • Bonaldi T, Straub T, Cox J, Kumar C, Becker PB, Mann M. Combined use of RNAi and quantitative proteomics to study gene function in Drosophila. Mol Cell. 2008 Sep 5;31(5):762-72. doi: 10.1016/j.molcel.2008.07.018.

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